本发明公开了一种人工设计自活化前导肽序列提高胰蛋白酶酶活的方法，属于基因工程领域。本发明构建的毕赤酵母工程菌，表达N端融合人工自活化前导肽序列TPAPPSDDLGTFDDDDK的胰蛋白酶。本发明得到的酵母工程菌GS115‑Sedeif的胰蛋白酶酶活(即胰蛋白酶酰胺酶酶活)达156U·mL‑1，酯酶酶活为15015.8U·mL‑1(以BAEE为底物)。是改造前的菌株胰蛋白酶酶活的1.82倍和3.29倍。该发明解决了胰蛋白酶异源表达量低的关键问题。应用该发明中的重组菌株生产胰蛋白酶，具产量高、发酵工艺简化、便于工业化应用的优点。